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提高細胞計數(shù)準確性的 7 個技巧

更新時間:2025-04-22      點擊次數(shù):199

細胞計數(shù)和細胞活力測量對于許多不同樣品類型的廣泛研究應用至關(guān)重要。治療和醫(yī)學研究細胞計數(shù)過程包括血液測量,如紅細胞計數(shù)、白細胞活力檢測和樹突狀細胞監(jiān)測??梢允褂醚蛴嫈?shù)器進行計數(shù),但手動計數(shù)的不準確和耗時性可能非常有限。使用自動細胞計數(shù)儀可獲得最佳結(jié)果,但仍需要考慮一些最佳實踐,以確保結(jié)果準確且可重現(xiàn)。無論您是手動計數(shù)細胞,還是使用 CellDrop™ 自動細胞計數(shù)儀等自動化系統(tǒng),這都適用。

1. 清潔樣品表面

對于每種細胞計數(shù)方法,樣品表面必須清潔。任何污染都可能導致結(jié)果不準確。手動細胞計數(shù)包括移除和清潔玻璃蓋玻片,然后用 70% 乙醇和水清潔計數(shù)室。使用一次性塑料載玻片時,每個樣品(如果載玻片有兩個腔室,則為一對樣品)都需要一張新的載玻片。

使用 CellDrop 系列儀器,腔室在兩個彼此平行的光學級藍寶石表面之間形成。樣品在表面之間移液,并通過表面張力固定到位。要清潔表面,只需用干燥的實驗室濕巾擦拭即可。

如需進一步清潔,用 15 μL 70% 乙醇或 10% 漂白劑沖洗腔室。加載后,讓溶液靜置 ~10 秒,然后用實驗室干抹布清潔表面。

圖 1:使用干燥、不起毛的實驗室抹布清潔樣品上下表面。

2. 加載前立即混合

在加載樣品之前立即混合對于確保分析樣品的代表性至關(guān)重要。

不同大小和類型的像元將以不同的速率沉降和聚集。在上樣前立即混合溶液可增加等分試樣均勻并準確反映細胞培養(yǎng)物特性的可能性。

3. 減少細胞聚集

細胞計數(shù)需要分析整個儲備液中的少量樣品,因此必須注意確保樣品具有原始儲備培養(yǎng)物的代表性。雖然像 CellDrop 這樣的細胞計數(shù)儀應用算法來識別團塊中的細胞,但它們無法校正不具有代表性的樣品。手動計數(shù)時,團塊的評分比單個細胞更主觀,這增加了用戶之間的可變性。

細胞裂解后的細胞外 DNA 和細胞碎片是結(jié)塊的常見原因。細胞裂解可能是由過度生長、過度移液造成的機械剪切、凍融循環(huán)以及胰蛋白酶消化不足或過度引起的,也可能導致樣品異質(zhì)性。通過避免細胞裂解的原因和過濾樣品中的細胞碎片,可以減少細胞團塊。

4. 優(yōu)化設(shè)置

無論是手動計數(shù)還是依靠軟件算法進行計數(shù),調(diào)整對焦和曝光設(shè)置以確保細胞的最佳可見性以獲得最準確的結(jié)果都很重要。

最佳對焦和曝光將顯示細胞膜和背景之間的鮮明對比。

針對熒光應用單獨優(yōu)化每個熒光通道的能力將產(chǎn)生最可重現(xiàn)的結(jié)果。應設(shè)置熒光強度以確保細胞在保持其實際大小的同時盡可能明亮。光線不應滲過細胞的邊緣。

圖 2:最佳焦距。正確的焦點(左)和對焦不佳的圖像(右)。
圖 3:曝光。正確曝光(左)、曝光過度(中)、曝光不足(右)。

5. 使用適當?shù)那皇腋叨?/span>

有一系列血球計數(shù)器可供選擇,深度和網(wǎng)格設(shè)計各不相同。請注意在計算中使用正確的詳細信息以避免錯誤。

CellDrop 具有一定功能,與其他基于玻片的計數(shù)儀相比,可實現(xiàn)更寬的細胞密度范圍。裝載室高度可通過軟件進行調(diào)整,以適應最寬的細胞密度和粒徑范圍。提供屏幕指導以確保最佳高度,并自動調(diào)整計算。

6. 調(diào)整計數(shù)參數(shù)

大多數(shù)自動細胞計數(shù)儀都包含可調(diào)整的設(shè)置,以最好地匹配正在研究的細胞。例如,可以設(shè)置并保存像元大小范圍,以從分析中排除碎片或其他像元群。

還提供了用于定義單元格形狀的設(shè)置。對于 CellDrop,可以在細胞計數(shù)之前或之后調(diào)整設(shè)置,并根據(jù)新參數(shù)重新分析數(shù)據(jù)。

7. 選擇明場或熒光

明場分析可有效計數(shù)培養(yǎng)的哺乳動物細胞。然而,使用臺盼藍可能很難區(qū)分活細胞和死細胞,并且對于許多原代細胞,需要熒光。

例如,外周血單核細胞 (PBMC) 通常與大量紅細胞 (RBC) 混合,使用明場分析可能顯示為“死亡"。然而,使用吖啶橙 (AO) 和碘化丙啶 (PI) 等染料,可以僅對有核 PBMC 進行染色,并使用雙重熒光功能區(qū)分活體和死體。

AO 和 PI 都可以對核酸進行染色,但只有 AO 可以穿過活細胞膜。因此,活的 PBMC 用 AO 染色并發(fā)出綠色熒光,死的 PBMC 用 AO 和 PI 染色并發(fā)出紅色熒光。紅細胞未染色,根本不發(fā)出熒光。


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